微藻叶绿体提取试剂盒

产品货号：

HR9113

中文名称：

微藻叶绿体提取试剂盒

英文名称：

Microalgae Chloroplast Isolation Kit

产品规格：

50T|100T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本试剂盒用简便快速的方法即可快速从各种微藻样本中提取得到叶绿体。可适配绝大多数模式微藻（如莱茵衣藻、小球藻）及经济微藻（如杜氏盐藻、金藻、硅藻等）。本试剂盒提取的叶绿体具有生物活性，可以用于叶绿体功能研究、叶绿体蛋白/核酸提取等各种下游应用。

产品组成：

组分	50T	100T
微藻洗涤液A	250mL	500mL
叶绿体提取液B	500mL	1000mL
叶绿体提取液C	100mL	200mL
叶绿体保存液D	50mL	100mL

保存：2～8℃，有效期1年。

用户自备：

仪器准备：离心机、Dounce匀浆器、超声细胞破碎仪、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒
试剂准备：1×PBS(pH7.4,10mM)
耗材准备：离心管、吸头、一次性手套、细胞筛（40μm/70μm）

注意事项：

有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。
预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10^-5×rpm² （r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米)例如:转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。
全程低温控制：所有试剂、耗材、离心腔提前预冷至0～4℃，操作全程冰浴，避免高温导致叶绿体膜破损和光合活性丧失。避光操作：叶绿素对强光敏感，全程在弱光环境下操作，样品全程避光保存，避免光照导致的色素降解和光合活性丧失。
以下部分操作步骤针对不同的微藻样品种类需要根据预实验情况调整操作条件。

使用方法：

取对数生长中期的微藻，置于4℃冰箱中避光静置24小时。
在2000×g离心5～10分钟，弃上清，收集微藻沉淀。
沉淀用PBS洗涤一次。
2000×g离心5分钟。
在1～2g微藻细胞沉淀中加入5mL微藻洗涤液A，充分混匀。
室温静置2～3分钟。
在2000×g离心10分钟，弃上清，收集微藻沉淀。
尽可能吸干上清。
在沉淀中加入10mL微藻提取液B，充分混匀。
用Dounce匀浆器轻柔匀浆20～30次。
- 选用A型（松型）Dounce匀浆器。禁用B型。
- 避免产生气泡。
- 上下一个来回为一次。
- 有条件可以取匀浆液镜检确认细胞破裂、叶绿体完整释放。
- 以上步骤最适样本为莱茵衣藻（CW系列）、杜氏盐藻、金藻、扁藻、甲藻、球等鞭金藻等。其他样本回收率会下降。
- 衣藻（野生型）、小球藻、硅藻、共生藻等样本有条件的话可以采用高压破碎仪、玻璃珠均质仪、超声破碎仪等方法处理。提取液B在200～300w，超声3s，间隔3s条件冰浴超声处理1～5分钟，避免发热，中途取少量样品镜检。不同藻类处理时间差异较大，可以根据预实验结果情况调整超声时间。没有超声条件可以将提取液微藻悬液加入研钵，加入少量石英砂进行轻微研磨。也可以用高压细胞破碎仪破碎细胞。
将提取液B用40～60μm尼龙细胞筛过滤。
没有细胞筛可以不过滤。
将滤液在4℃，800×g离心3分钟，弃沉淀，保留上清。
将上清在4℃，3000×g离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
亮绿色沉淀。
用2mL预冷的试剂C重悬沉淀。
用预冷的缓冲液C轻柔重悬沉淀，避免剧烈吹打。
在4℃，3000×g离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
沉淀即为叶绿体。
用1mL预冷的叶绿体保存液D或其他相应的缓冲液重悬叶绿体，置冰箱备用或直接用于下游实验。
- 也可以不用试剂盒中的叶绿体保存液，根据下游实验需要，将叶绿体直接用于下游实验或者用自己的缓冲液保存叶绿体。
- 用预冷的缓冲液D轻柔重悬沉淀，避免剧烈吹打。

常见问题：

问题	可能原因	解决方法
叶绿体破碎率高	破碎过度	降低破碎强度
纯度低	离心速度/时间不当	优化差速离心参数，增加梯度纯化步骤
活性低	操作时间过长	缩短操作时间
活性低	温度过高	严格控制4℃环境
得率低	细胞破碎不充分	优化破碎方法（如延长酶解时间/增加超声次数）

附录参考：
叶绿体如何鉴定：

形态与完整率鉴定：
- 显微镜镜检：荧光显微镜下，完整叶绿体呈饱满椭球形，红色叶绿素自发荧光均匀，无皱缩、破裂、荧光渗漏；相差显微镜可观察到完整的双层被膜，台盼蓝染色拒染。
- 完整率定量：铁氰化钾光还原法，完整叶绿体外膜无法透过铁氰化钾，通过测定渗透休克前后的铁氰化钾光还原速率，计算叶绿体完整率，合格样品完整率≥80%。
纯度鉴定：
- Western Blot验证：叶绿体标记蛋白显著富集，无细胞核、线粒体、过氧化物酶体标记蛋白的明显污染。
- 叶绿素比值验证：绿藻完整叶绿体的叶绿素a/b比值稳定在2～3:1，比值异常提示破碎叶绿体或杂质污染。
活性鉴定：光合放氧速率测定、光系统II（PSII）最大光化学效率（Fv/Fm）检测，高活性离体叶绿体Fv/Fm≥0.65。
离体叶绿体翻译活性在15～30min内快速丧失，光合活性实验必须现提现用。

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